LFL Forschung

Was ist Photodynamische Therapie?

Unter der Photodynamische Therapie (PDT) versteht man ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren mit Licht in Kombination mit einem sog. Photosensibilisator. Dazu wird dem Patienten ein solcher Sensibilisator, oder eine Pre-Drug aus der sich der Sensibilisator bildet, verabreicht, welche(r) sich selektiv im Tumor anreichert. Anschließend wird der Tumor und dass ihn umgebende gesunde Gewebe mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt. Dabei wird durch photochemische Prozesse ein phototoxischer Effekt erzeugt, bei dem toxische Substanzen oder reaktive Sauerstoffspezis erzeugt werden, welche aufgrund der Tumorselektivität des Sensibilisators gezielt die Tumorzellen schädigen.

Prinzip der 5-ALA interstitiellen Photodynamischen Therapie (iPDT) für Gehirntumore. Nach Verabreichung von 5-ALA (2) entsteht selektiv in Tumor PpIX (3). In den Tumor werden Lichtwellenleiter implantiert (4) und nach Einschalten des Lasers und während der Bestrahlung entstehen reaktive Sauerstoffspezies (ROS / Singulet Sauerstoff 1O2; (5)) Durch die phototoxische Reaktion des ROS werden die Tumorzellen geschädigt und sterben (6).

Gegenüber einer chirurgischen Behandlung bietet die PDT den Vorteil einer weitaus geringeren Invasivität des Verfahrens. Im Falle oberflächlicher Tumore entfällt die Resektion von umliegenden gesunden Gewebe. Bei interstitiellen Tumoren reduziert sich das Risiko und die Beeinträchtigung gesundem Gewebes, da der chirurgische Eingriff weitaus geringer ausfällt. Die PDT erfolgt nur unter Narkose im Falle der Behandlung schwer zugänglicher interstitieller Tumore wie beispielsweise im Gehirn. Die Bestrahlung während der PDT erfolgt mittels Lichtquellen mit denen der Tumor direkt bestrahlt wird. Interstitielle Tumore können unter Verwendung von Endoskopen oder mittels Lichtapplikatoren / Lichtdiffusoren direkt bestrahlt, die für die Dauer der Bestrahlung im Rahmen eines chirurgischen Eingriffs implantiert werden und so das Tumorvolumen ausleuchten. Je nach Tumor und Photosensitizer kann die Dauer der Bestrahlung zwischen 10-100 Minuten andauern. Die Erwärmung des Gewebes beträgt wenige °C.

Das Verfahren der PDT wurde bereits zur Jahrhundertwende (19./20. Jhd.) in München entdeckt und untersucht, erlangte aber erst in den 80er Jahren durch den Einsatz von Lasern eine gewisse Verbreitung. Derzeit wird die PDT bereits vielfältig eingesetzt und weitere Behandlungsfelder erforscht. In der Onkologie werden PDT Anwendungen für Tumore der Haut, Blase, Prostata, Mundhöhle, Lunge, Genitalbereich, und Gehirn eingesetzt und entwickelt. Neben einer onkologischen Anwendung der PDT, kann diese auch zur allgemeinen Behandlung verschiedener Hautkrankheiten, im Bereich der Zahnmedizin oder antibakteriell eingesetzt werden.

Als Photosensibilisatoren werden überwiegend Porphyrine eingesetzt, die bei Bestrahlung mit rotem Licht mit einer Wellenlänge von 630-635 nm zur Bildung von Singulett-Sauerstoff führen, einem energetisch angereicherten und damit reaktionsstarkem und toxischem O²-Molekül.

In einigen Feldern der PDT wird 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) eingesetzt, das selektiv in Tumorzellen eine Porphyrinsynthese anregt. Es entsteht Protoporphyrin IX (PpIX), welches sich in großen Mengen im Tumor anreichert. Andere Sensibilisatoren lassen sich bei noch größeren Wellenlängen anregen mit dem Vorteil einer größeren Eindringtiefe des Lichtes in das Gewebe. Photosensibilisatoren fluoreszieren in der Regel und werden daher auch in der Fluoreszenzdiagnostik von Tumoren eingesetzt.

Die verwendeten Sensibilisatoren reichern sich auch in gesunden Zellen an, wenn auch in der Regel deutlich geringer als in Tumorzellen. Da der Sensibilisator bei den photochemischen Prozessen lediglich als Katalysator agiert, führt eine große Lichtdosis in gesunden Gewebe nur bedingt zu dessen Schädigung, da erstens im gesunden Gewebe die angereicherte Menge zu gering ist, um ausreichend Sauerstoff für Schäden zu aktivieren und zweitens das angereicherte Porphyrin, welches als Sensibilisator dient, von den gesunden Zellen zu nicht phototoxischen Substanzen weitermetaboliert wird. (Diese Weiterverarbeitung ist den Tumorzellen aufgrund fehlender/unterexprimierter Enzyme nicht möglich). Viele Sensibilisatoren, wie z. B. die 5-ALA-induzierten Porphyrine, bleichen im Verlauf der Bestrahlung aus. Dadurch ist die photochemische Wirkung begrenzt. Bei entsprechender Substanzdosis kann daher auch eine beliebig hohe Lichtdosis appliziert werden, ohne dass das gesunde Gewebe Schaden nimmt. Eine hohe Lichtdosis ist zudem mit einer tieferen therapeutischen Wirkung im Gewebe verbunden, wodurch auch infiltrativ entstandene Tumorzellen geschädigt werden können.

Details zur Fluoreszenzdiagnostik

Trotz Ultraschall, Röntgen, Kernspin und anderen bildgebenden Diagnoseverfahren ist der Operateur letztlich auf sein geschultes Auge angewiesen, wenn er vor einem Patienten steht und einen Krebsherd entfernen soll. Im Detail ist dann die Unterscheidung zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe oft schwierig. Bei großen Tumoren ist die Abgrenzung zum Normalgewebe die Herausforderung, bei Frühkarzinomen die Erkennung an sich. Die Fluoreszenzdiagnostik soll hier Hilfestellung leisten, indem sie Tumore durch Fluoreszenz deutlich sichtbar darstellt.

Dazu wird dem Patienten ein Fluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) verabreicht, der sich selektiv im Tumor anreichert. Wird das entsprechende Areal z. B. mit blauem Licht beleuchtet, so wandelt der Farbstoff dieses Licht aufgrund seiner Fluoreszenzeigenschaft in rotes um. Ein mit bloßem Auge kaum oder gar nicht erkennbarer Tumor hebt sich dadurch deutlich vom Hintergrund ab.

Man unterscheidet dabei zwei Vorgehensweisen:

• Die Autofluoreszenzdiagnostik beschränkt sich auf die Untersuchung der körpereigenen (endogenen) Fluorophore
• Meist werden aber geeignete Farbstoffe vor der Untersuchung verabreicht (exogene Fluorophore).
  Weit verbreitet ist dabei ein Verfahren, bei dem dem Patienten die Vorläufersubstanz 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) verabreicht wird, worauf eventuell vorhandene Tumorzellen mit einer vermehrten Bildung und Anreicherung des eigentlichen Fluoreszenzfarbstoffes Protoporphyrin IX (PPIX) reagieren. Dies ist nachfolgend dargestellt.

Hier das Beispiel eines bösartigen Gehirntumors. Links die Ansicht bei weißer Beleuchtung, rechts bei blauer Beleuchtung. Die rote Fluoreszenz (rechtes Bild), die ausschließlich im Tumorgewebe gebildet wird, wenn der Patient vor der Operation 5-ALA erhält, erleichtert die vollständige und gleichzeitig schonende Entfernung der Tumormasse. Unter Fluoreszenzsicht operierte Patienten haben nach unseren bisherigen Ergebnissen eine längere Überlebenszeit.

Diese Aufnahmen wurden über ein Endoskop aus der Harnblase gewonnen. Im linken Bild ist unter normaler Sicht nur ein Tumor zu erkennen. Erst die Fluoreszenzdarstellung rechts zeigt einen weiteren kleinen Tumor.

Fluoreszenznachweis

Zum Nachweis der Fluoreszenz muss das Gewebe mit Licht geeigneter Wellenlänge angeregt werden, wofür sich Laser, LED-Systeme oder gefilterte Lampensysteme einsetzen lassen. Die Fluoreszenz kann dann auf unterschiedliche Art und Weise erfasst werden:

• Bildgebend (Intensität ortsaufgelöst)
• Spektral (Intensität in Abhängigkeit der Wellenlänge)
• Zeitaufgelöst (Schnelligkeit des Abklingens der angeregten Moleküle)

Für klinische Anwendungen ist die bildgebende Darstellung, wie in den Bildbeispielen gezeigt, die praktikabelste Darstellungsform. Die spektralen und zeitaufgelösten Fluoreszenzerfassungen können jedoch wertvolle Zusatzinformationen liefern, insbesondere bei der Suche nach neuen tumorselektiven Substanzen.

Im Laser-Forschungslabor wurde insbesondere die endoskopische und operationsmikroskopische bildgebende Fluoreszenzdarstellung unter Verwendung 5-ALA mit industriellen Partnern bis zur klinischen Anwendungsreife entwickelt. In mehreren Bereichen laufen derzeit Zulassungsstudien. Zahlreiche deutsche Kliniken sind an diesen Studien beteiligt und setzen das Verfahren ein.

5-ALA ist eine körpereigene Substanz, die Ausgangssubstanz für die Synthese von Häm ist, das für die Zellatmung benötigt wird. Das körpereigene 5-ALA ist jedoch immer nur in so geringer Menge vorhanden, dass auf dem Syntheseweg zum Häm keine Zwischenprodukte anreichern. Dies ändert sich, wenn 5-ALA von außen zugeführt wird: Insbesondere Tumorzellen nehmen 5-ALA auf und reichern den Vorläufer des Häm-Moleküls, PPIX an. PPIX ist in diesem Syntheseweg die einzige fluoreszierende Substanz und gleichzeitig ein Photosensibilisator, so dass eine wohldosierte Verabreichung von 5-ALA nicht nur die Tumor-Fluoreszenzdiagnostik sondern auch die Photodynamische Therapie ermöglicht.

Häm-Biosynthese: Bei extrazellulärem Angebot von 5-ALA kommt es in den Mitochondrien zu einer Anreicherung von rot fluoreszierendem PPIX. (nach Hofstetter, A., Adam, C. (Eds.), 2003. Lasergestützte Operationsverfahren in der Urologie, 1. Aufl. ed. Thieme, Stuttgart.)

Die Produktion des Fluorophors durch die Körperzellen selbst bietet viele Vorteile gegenüber der Verabreichung eines synthetischen Fluorophors:

• Geringe Nebenwirkungen.
• Schnelle Umwandlung und Ausschleusung aus dem Körper.
• Hoher Kontrast, weil das Fluorophor nicht nach der Verabreichung zirkuliert und unspezifische Fluoreszenz verursacht.
• Hoher Kontrast, weil Binde- und Muskelgewebe kaum PPIX akkumulieren.

Neue Fluorophore für die Fluoreszenzdiagnostik

Speziell für die Diagnostik von Harnblasentumoren werden derzeit zwei neue Substanzen getestet, eine modifizierte Form von 5-ALA und der Naturstoff Hypericin (Wirkstoff im Johanniskraut). Die Gründe, überhaupt nach neuen Substanzen zu suchen liegen in folgenden Unzulänglichkeiten von 5-ALA:

• Es werden häufig entzündliche, aber nicht bösartige Gewebeveränderungen unerwünschterweise fluoreszenzmarkiert (geringe Spezifität).
• Gelegentlich ist die Akkumulation im Tumorgewebe inhomogen.
• Die Fluoreszenz bleicht während der Beleuchtung rasch aus.

Mit einer chemischen Modifizierung des 5-ALA (Hexyl-ALA) konnte die Gewebepenetration verbessert werden, so dass wesentlich geringere Konzentrationen zu einer eher verstärkten Kontrastierung führen.

Hypericin lässt sich wie 5-ALA oder Hexyl-ALA zur Verabreichung in die Blase instillieren und führt zu einer hoch tumorselektiven Fluoreszenz, die so gut wie kein Ausbleichen zeigt. Erfreulicherweise ist das für 5-ALA entwickelte Equipment auch für die Fluoreszenzbildgebung mit Hexyl-ALA und Hypericin geeignet.

Eisenmangel

Eisenmangel betrifft weltweit mehr als 2 Milliarden Menschen, mehr als jedes andere Gesundheitsproblem. In roten Blutkörperchen ist das Molekül Zink-Protoporphyrin ein natürlicher Marker für Eisenmangel und kann mittels Fluoreszenzmessungen bestimmt werden.

Zink-Protoporphyrin

Zink-Protoporphyrin entsteht im Rahmen der Häm-Synthese. Dabei wird im letzten Schritt Eisen in das Molekül Protoporphyrin IX eingebaut. Wenn nicht genügend Eisen zur Verfügung steht, also im Falle eines Eisenmangels, wird stattdessen zweiwertiges Zink eingebaut. Dies führt zur verstärkten Bildung des Moleküls Zink-Protoporphyrin in roten Blutkörperchen, wo es während deren Lebensdauer verbleibt und als Eisenmangelmarker dient. Insbesondere steigt das Zink-Protoporphyrin bei einem entstehenden Eisenmangel an, bevor der Hämoglobinwert erkennbar abfällt, so dass Zink-Protoporphyrin als Eisenmangelparameter geeigneter ist als der Hämoglobinwert.

Nicht-invasive Messung

Am Laser-Forschungslabor wird ein Gerät entwickelt, das Zink-Protoporphyrin fluoreszenzspektroskopisch an der Unterlippe misst, ohne dass eine Blutentnahme erforderlich ist. Die größte Hürde für die Messung ist die Gewebeeigenfluoreszenz, die um Größenordnungen stärker ist als die Fluoreszenz der Zink-Protoporphyrin-Moleküle in den roten Blutkörperchen. Darüber hinaus müssen die Stellen der Unterlippe identifiziert werden, die für eine quantitative Messung geeignet sind. Diese Schwierigkeiten wurden mittlerweile überwunden, sodass nun eine Methode zur Verfügung steht, die in weniger als einer Minute nicht-invasiv den Eisenstatus bestimmen kann.

Details zu diesem Thema finden sich in den folgenden Veröffentlichungen:

Details zu Thermischen Laseranwendungen

Die thermische Wirkung von Laserlicht wird klinisch für die Koagulation von Gewebe sowie zum Abtragen und Schneiden eingesetzt. Aufgrund der Entwicklung neuer Lasertechnologien ist die Untersuchung der Licht-Gewebe-Wechselwirkung sowie die Entwicklung geeigneter Applikationssysteme Ziel der klinischen Forschung.

Unter der thermischen Wirkung von Laserstrahlung in der Medizin ist im Wesentlichen das Verdampfen und Koagulieren von Gewebe zu verstehen. In Abb. 1 sind die unterschiedlichen Laserwirkungen in Abhängigkeit von Leistungsdichte und Einwirkzeit dargestellt. Die thermischen Laserapplikationen liegen sowohl hinsichtlich der Einwirkzeit als auch in der nötigen Leistungsdichte zwischen der Photodynamischen Therapie und den nichtlinearen Prozessen der Licht-Gewebe-Wechselwirkung.

Abb. 1: Bereiche von Leistungsdichte und Einwirkzeit für die verschiedenen medizinischen Laserapplikationen. (nach Boulnois, J.-L., 1986. Photophysical processes in recent medical laser developments: A review. Laser Med Sci 1, 47–66. DOI: 10.1007/BF02030737)

Die unterschiedlichen thermischen Wirkungen (reversible und irreversible Gewebeschädigung) können anhand der laserinduzierten Temperatur und der Dauer der Temperatureinwirkung charakterisiert werden (siehe Abb. 2).

Abb. 2: Gewebeschädigung durch Wärme.

Die thermische Wirkung der Laserstrahlung im Gewebe beruht auf der Absorption der Strahlung durch das Gewebe und der damit verbundenen Umwandlung der Lichtenergie in Wärme.

In der Tiefe des Gewebes nimmt die absorbierte Strahlungsmenge nach dem Lambert-Beer´schen Gesetz ab und damit auch die induzierte Wärmemenge und die Temperatur. Gleichzeitig wird Wärme durch die Wärmeleiteigenschaften des Gewebes und dem Blutstrom (Perfusion des Gewebes mit Blut) abgeführt. Die sich einstellende Gewebetemperaturverteilung ist somit abhängig von den optischen und thermischen Eigenschaften des Gewebes.

In Tab. 1 sind die Veränderungen im Gewebe in Abhängigkeit von der Temperatur aufgelistet.
µ_s:Streukoeffizient [1/mm], µ_a: Absorptionskoeffizient [1/mm], 𝜅: Wärmeleitfähigkeit [W/m*K]

Abb. 3: Wirkung von Wärme auf Gewebe.

Photoablation und die Photovaporisation sind gewebeabtragende Effekte, die sich in ihren zeitlichen Abläufen unterscheiden.

Lasersysteme mit Emissionswellenlängen mit großer optischer Eindringtiefe werden für die thermische Denaturierung von Geweberegionen (Koagulation) verwendet. Koagulationsverfahren werden klinisch sowohl oberflächlich als auch interstitiell angewendet. Für die interstitielle Anwendung werden spezielle Lichtwellenleiter direkt im zu behandelnden Gewebe positioniert.

Literatur:

• Angewandte Lasermedizin, Lehr- und Handbuch für Klinik und Praxis,
  Hrsg. H.-P. Berlien, G. Müller, Landsberg a. L., München, ecomed-Verlags-Gesellschaft

Was ist Endomikroskopie?

Endomikroskopie ist der Ansatz, Gewebe in direktem Kontakt mit einer Mikroskopoptik an der Spitze eines Endoskops vor Ort zu diagnostizieren. Von besonderem Interesse ist dabei die Zwei-Photonen-Endoskopie. Sie hat den Vorteil, dass kein Störlicht außerhalb der Betrachtungsebene entsteht.

Forschungsschwerpunkte des LFL zur Mikroendoskopie

Die Herausforderung für eine endoskopische Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist neben der Miniaturisierung der einzelnen Komponenten vor allem eine effiziente Einkopplung der Laserpulse in ein bildgebendes Faserbündel. Durch die Wechselwirkung mit dem Material des Glasfaserkerns werden die Laser-Pulse deformiert. Diese Interaktion und mögliche Kompensationen der Deformation werden derzeit am Laser-Forschungslabor untersucht.

Was ist optische Kohärenztomographie?

Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist ein Verfahren, das die Darstellung von Gewebestrukturen bis zu einer Tiefe von einigen Millimetern gestattet. Ähnlich wie beim Ultraschall werden dabei Schnittbildern senkrecht zur Oberfläche erzeugt. Es lassen sich jedoch ca. 100fach kleiner Strukturen darstellen, d. h. auch Objekte mit einer Größe unter 10µm. Der dargestellte Detailreichtum ist daher trotz der geringen Eindringtiefe erheblich. Bei der OCT werden über ein interferometrisches Verfahren diejenigen Lichtteichen herausgefiltert, die genau einmal im Gewebeinneren gestreut wurden und daher Informationen über die Position dortiger Strukturen transportieren. Das Verfahren wird bereits in der Dermatologie und Ophthalmologie eingesetzt. Auch endoskopisch einsetzbare Versionen wurden bereits entwickelt. 

Forschungsschwerpunkte des LFL zur optischen Kohärenztomographie

• Darstellung von Strukturen im Mittelohr durch das Trommelfell hindurch.

Ein gläserner Patient wäre hinsichtlich der diagnostischen Möglichkeiten der Traum eines jeden Arztes. Optische Kohärenztomographie (OCT) lässt diesen Traum zumindest bis in eine Gewebetiefe von ca. 2mm wahr werden. Da dabei Objekte mit Durchmessern von 10µm und weniger noch dargestellt werden können, ist die Anzahl der erkennbaren Details erheblich (siehe Abbildung).

Da Lichtteilchen, die in biologisches Gewebe eindringen, vielfach gestreut werden, sind wir undurchsichtig. Licht, das von Gewebe zurückgestreut wird, enthält so gut wie keine Informationen über innere Gewebestrukturen mehr. Mit der OCT gelingt es jedoch, genau diejenigen Lichtteilchen herauszufiltern, die ins Gewebe eingedrungen sind, dort genau einmal gestreut wurden und anschließend das Gewebe wieder verlassen habe. Diese Lichtteilchen transportieren Informationen über die Position der Gewebestrukturen, an denen sie gestreut wurden, genau wie im Falle eines gläsernen Patienten.

Bei der OCT werden die genau einmal im Gewebe gestreuten Lichtteilchen anhand ihrer Interferenzfähigkeit herausgefiltert. Dazu wird ein Lichtstrahl mit einer Kohärenzlänge von nur ca. 10µm senkrecht zur Gewebeoberfläche eingestrahlt und das zurückgestreute Licht mit Hilfe einer interferometrischen Anordnung nach Art eines Michelson-Interferometers analysiert. Nur einfach gestreutes Licht, dessen Wegstrecke sich vor der des Referenzarms des Interferometers um weniger als die Kohärenzlänge unterscheidet, trägt zum Interferenzsignal bei. Die räumliche Auflösung in Strahlrichtung entspricht daher der Kohärenzlänge des verwendeten Lichtes. Die kontinuierliche Variation der Referenzarmlänge in Kombination mit lateralem Vorschub der Optik erlaubt schließlich die Darstellung von 2-dimensionalen Schnittbildern senkrecht zur Gewebeoberfläche.

Dargestellt wird die räumliche Verteilung des Streukoeffizienten. Ab einer Tiefe von ca. 2mm lassen sich die Interferenzoszillationen, die durch die kontinuierliche Veränderung der Referenzarmlänge provoziert werden, nicht mehr aus dem Untergrund der mehrfach gestreuten Lichtteilchen herausfiltern, da die Zahl der bis in diese Tiefe vorgedrungenen genau einmal gestreuten Teilchen nur noch sehr gering ist.